藥用植物代謝組學(xué)
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摘要：從技術(shù)步驟、分析方法以及實(shí)際應(yīng)用三個(gè)方面對(duì)當(dāng)前藥用植物代謝組學(xué)研究領(lǐng)域的一些理論問(wèn)題和實(shí)踐中面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行綜述。
關(guān)鍵詞：藥用植物；代謝組學(xué)；功能基因組學(xué)
代謝組學(xué)是對(duì)生物體內(nèi)代謝物進(jìn)行大規(guī)模分析的一項(xiàng)技術(shù)［1］，它是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分（如圖1所示），藥用植物代謝組學(xué)主要研究外界因素變化對(duì)植物所造成的影響，如氣候變化、營(yíng)養(yǎng)脅迫、生物脅迫，以及基因的突變和重組等引起的微小變化，是物種表型分析最強(qiáng)有力的工具之一。在現(xiàn)代中藥研究中，代謝組學(xué)在藥物有效性和安全性、中藥資源和質(zhì)量控制研究等方面具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。另外，在對(duì)模式植物突變體文庫(kù)或轉(zhuǎn)基因文庫(kù)進(jìn)行分析之前，代謝組學(xué)往往是首先考慮采用的研究方法之一。目前，國(guó)外已有成功利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)擬南芥突變株進(jìn)行大規(guī)?；蚝Y選的例子，這為與重要性狀相關(guān)基因功能的闡明和選育可供商業(yè)化利用的轉(zhuǎn)基因作物奠定了基礎(chǔ)。
圖1系統(tǒng)生物學(xué)研究的四個(gè)層次略
目前，還有許多經(jīng)濟(jì)作物的全基因組測(cè)序計(jì)劃尚未完成，由于代謝組學(xué)研究并不要求對(duì)基因組信息的了解，所以在與這些作物有關(guān)的研究領(lǐng)域具有更大的利用價(jià)值，這也是其與轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)研究相比的優(yōu)勢(shì)之一。代謝組學(xué)研究涉及與生物技術(shù)、分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)和信息學(xué)相關(guān)的大量知識(shí)，F(xiàn)iehn［2］對(duì)代謝組學(xué)有關(guān)的研究方向進(jìn)行了分類（見(jiàn)表1）。
1代謝組學(xué)研究的技術(shù)步驟
代謝組學(xué)研究涉及的技術(shù)步驟主要包括植物栽培、樣本制備、衍生化、分離純化和數(shù)據(jù)分析5個(gè)方面（見(jiàn)圖2）。
1.1植物栽培
對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行培育的目的是為了對(duì)樣本的穩(wěn)定性進(jìn)行控制，相對(duì)于微生物和動(dòng)物而言，植物的人工栽培需要考
表1代謝組學(xué)的分類及定義略
慮更多的問(wèn)題，如中藥材在不同年齡、不同發(fā)育階段、不同部位以及光照、水肥、耕作等環(huán)境因素的微小差異都可引起生理狀態(tài)的變化，而這些非可控及可控雙重因素的影響很難進(jìn)行精確的控制，從而影響藥用植物代謝組研究的重復(fù)性。為了解決以上問(wèn)題，推薦使用大容量的培養(yǎng)箱［3］，定時(shí)更換培養(yǎng)箱中栽培對(duì)象的位置，以及使用無(wú)土栽培技術(shù)等，F(xiàn)ukusakiE［4］利用無(wú)土栽培系統(tǒng)將水和養(yǎng)分直接引入植物根部，并且對(duì)供給量進(jìn)行精確地控制，大大提高了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。
1.2樣本制備
為了獲得穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，樣本制備需要考慮樣本的生長(zhǎng)、取樣的時(shí)間和地點(diǎn)、取樣量以及樣本的處理方法等問(wèn)題，并根據(jù)分析對(duì)象的分子結(jié)構(gòu)、溶解性、極性等理化性質(zhì)及其相對(duì)含量大小對(duì)提取和分離的方法進(jìn)行選擇，逐一優(yōu)化試驗(yàn)方案。MaharjanRP等［5］用6種方法分別對(duì)大腸桿菌中代謝產(chǎn)物進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)用－40℃甲醇進(jìn)行提取的效果最好?，F(xiàn)階段代謝組學(xué)的分析對(duì)象主要集中在親水性小分子，尤其是初級(jí)代謝產(chǎn)物，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GCMS)和毛細(xì)管電泳質(zhì)譜（CEMS）聯(lián)用都是分析親水小分子的重要技術(shù)。FiehnO等［6］使用GCMS對(duì)擬南芥葉片中的親水小分子進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)酒石酸半縮醛、檸蘋酸、別蘇氨酸、羥基乙酸等15種植物代謝物。
1.3衍生化處理
對(duì)目標(biāo)代謝產(chǎn)物的衍生化處理取決于所使用的分析設(shè)備，GCMS系統(tǒng)只適合對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，高效液相色譜法（HPLC）一般則使用紫外或熒光標(biāo)記的方法對(duì)樣本進(jìn)行衍生處理，BlauK［7］對(duì)酯化、?；?、烷基化、硅烷化、硼烷化、環(huán)化和離子化等衍生方法進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明。然而離子化抑制常使得質(zhì)譜分析過(guò)程中目標(biāo)代謝產(chǎn)物的離子化效率降低，這主要是由于分離過(guò)程中污染物與目標(biāo)代謝物難以完全分離開(kāi)所引起的，優(yōu)化色譜分離時(shí)間可有效緩解離子化抑制，然而在實(shí)際操作中不可能對(duì)上百種代謝產(chǎn)物的分離時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，利用非放射性同位素稀釋法進(jìn)行相對(duì)定量可以很好的解決該問(wèn)題。HanDK等［8］應(yīng)用同位素編碼的親和標(biāo)記（ICAT），根據(jù)經(jīng)誘導(dǎo)分化的微粒蛋白及其同位素標(biāo)記物的峰面積比，對(duì)該蛋白的相對(duì)含量進(jìn)行分析。ZhangR等［9］發(fā)現(xiàn)同位素標(biāo)記技術(shù)也可用于代謝組學(xué)的研究，但是卻存在許多困難?；铙w的同位素標(biāo)記方法對(duì)于同位素的洗脫是一種非常有潛力的技術(shù)，目前關(guān)于使用34s的研究已有報(bào)道［10］。
圖2代謝組學(xué)研究技術(shù)步驟略
1.4分離和定量
分離是代謝組學(xué)研究中的重要步驟，與質(zhì)譜聯(lián)用的色譜和電泳分析技術(shù)都是使用紫外或電化學(xué)檢測(cè)的方法進(jìn)行定量，其對(duì)代謝組數(shù)據(jù)的分辨率與定量能力都有一定的影響。TomitaM等［11］總結(jié)了各種色譜分離法中經(jīng)常遇到的技術(shù)問(wèn)題，認(rèn)為毛細(xì)管電泳和氣相色譜法由于具有較高的分辨率，已成為代謝組學(xué)研究的常規(guī)技術(shù)手段之一，液相色譜因其適用范圍廣，應(yīng)用也相當(dāng)廣泛。
TanakaN等［12］用高效液相色譜對(duì)樣品進(jìn)行分離，認(rèn)為使用硅膠基質(zhì)填充毛細(xì)管整體柱的高效液相色譜系統(tǒng)具有用量少、靈敏性高、低壓降高速分離等優(yōu)勢(shì)；同時(shí)，TolstikovV等［13］也使用硅膠填充的毛細(xì)管液相色譜方法對(duì)聚戊烯醇類異構(gòu)體進(jìn)行了有效分離，獲得了很好的分辨率。TanakaN等［14］發(fā)現(xiàn)二維毛細(xì)管液相色譜法的分辨率比傳統(tǒng)的高效液相法高10倍。相對(duì)于其他色譜方法而言，超臨界流體色譜（SFC）是分離疏水代謝物最具潛力的技術(shù)之一，特別適用于分離那些傳統(tǒng)HPLC難以分析的疏水聚合物，BambaT等［15］通過(guò)SFC對(duì)聚戊烯醇進(jìn)行分析，證明其具有較好的分離能力。針對(duì)質(zhì)譜中存在的共洗脫現(xiàn)象，HalketJM等［16］發(fā)明了一種適用于GCMS的反褶積系統(tǒng)，對(duì)共洗脫的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離與識(shí)別。AharoniA等［17］使用傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FTICRMS）對(duì)非目標(biāo)代謝物進(jìn)行分析，快速掃描植物突變樣品，獲得了一定量的代謝成分。
與分離一樣，定量能力也是代謝組學(xué)研究中的重要因素，其取決于各分析系統(tǒng)的線性范圍。傅立葉轉(zhuǎn)換核磁共振（FTNMR)、傅立葉紅外光譜（FTIR）以及近場(chǎng)紅外光譜法（NIR）等技術(shù)由于敏感性低，重復(fù)性受共洗脫現(xiàn)象影響較小也被用于檢測(cè)中。近年來(lái)，F(xiàn)TNMR技術(shù)常被用于植物代謝組的指紋圖譜研究［18］，但由于NMR分析需要樣品量較大，分析結(jié)果易受污染，GriffinJL［19］發(fā)現(xiàn)將統(tǒng)計(jì)模式識(shí)別與FTNMR相結(jié)合可以對(duì)代謝物進(jìn)行全面分析。除FTNMR之外，F(xiàn)TIR通過(guò)對(duì)有機(jī)成分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行常規(guī)光譜測(cè)定，也可適用于代謝組學(xué)的研究，特別是應(yīng)用于構(gòu)建代謝組學(xué)的指紋圖譜。盡管它不能對(duì)代謝物進(jìn)行全面分析，但對(duì)具有特定功能的組分卻有很好的定量效果，對(duì)從工業(yè)及食品原材料中分離的代謝混合物也可以進(jìn)行全面分析，目前，已有學(xué)者將其成功地應(yīng)用于擬南芥［20］和番茄［21］代謝產(chǎn)物指紋圖譜的研究中。
1.5數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換
為闡明代謝物復(fù)雜的線性或非線性關(guān)系，需要進(jìn)行多變量分析，將原始的色譜圖數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為數(shù)字化的矩陣數(shù)據(jù)，通過(guò)對(duì)色譜峰鑒定和整合從而進(jìn)行多變量分析。由于環(huán)境等因素的干擾，光譜數(shù)據(jù)需要通過(guò)適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)加工方法進(jìn)行校正，包括：①降低噪聲；②校正基線；③提高分辨率；④數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。JonssonP等［22］報(bào)道了一種關(guān)于GCMS色譜圖數(shù)據(jù)處理的方法，可以對(duì)大量代謝產(chǎn)物樣品進(jìn)行有效的識(shí)別。
2代謝組學(xué)中的數(shù)據(jù)分析方法
2.1主成分分析法（PCA）
主成分分析法，將實(shí)測(cè)的多個(gè)指標(biāo)用少數(shù)幾個(gè)潛在的相互獨(dú)立的主成分指標(biāo)線性組合來(lái)表示，反映原始測(cè)量指標(biāo)的主要信息。使得分析與評(píng)價(jià)指標(biāo)變量時(shí)能夠找出主導(dǎo)因素，切斷其他相關(guān)因素的干擾，作出更為準(zhǔn)確的估量與評(píng)價(jià)。PCA數(shù)據(jù)矩陣通常來(lái)自于GCMS，LCMS或CEMS，因此將目標(biāo)代謝產(chǎn)物作為自變量，而相應(yīng)的代謝產(chǎn)物含量作為因變量，定義與最大特征值方向一致的特征向量為第一主成分，依此類推，PCA便能通過(guò)對(duì)幾個(gè)主要成分的分析，從代謝組中識(shí)別出有效信息。主成分分析有助于簡(jiǎn)化分析和多維數(shù)據(jù)的可視化，但是該方法可能導(dǎo)致一部分有用信息的丟失。
2.2層次聚類分析法（HCA）
層次聚類分析法也常用于代謝組學(xué)的研究中，它是將n個(gè)樣品分類，計(jì)算兩兩之間的距離，構(gòu)成距離矩陣，合并距離最近的兩類為一新類，計(jì)算新類與當(dāng)前各類的距離。再合并、計(jì)算，直至只有一類為止。進(jìn)行層次聚類前首先要計(jì)算相似度（similarity），然后使用最短距離法（NearestNeighbor）、最長(zhǎng)距離法（FurthestNeighbor）、類間平均鏈鎖法（BetweengroupsLinkage）或類內(nèi)平均鏈鎖法（WithingroupsLinkage）四種方法計(jì)算類與類之間的距離。該方法雖然精確，但計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)密集，對(duì)大量數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行分析時(shí)，更適合選用K均值聚類法(KMC)或批次自組織映射圖法(BLSOM)，而HCA適合將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為主成分后使用。2.3自組織映射圖法(SOM)
神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中鄰近的各個(gè)神經(jīng)元通過(guò)側(cè)向交互作用相互競(jìng)爭(zhēng)，發(fā)展成檢測(cè)不同信號(hào)的特殊檢測(cè)器，這就是自組織特征映射的含義。其基本原理是將多維數(shù)據(jù)輸入為幾何學(xué)節(jié)點(diǎn)，相似的數(shù)據(jù)模式聚成節(jié)點(diǎn)，相隔較近的節(jié)點(diǎn)組成相鄰的類，從而使多維的數(shù)據(jù)模式聚成二維節(jié)點(diǎn)的自組織映射圖。除PCA和HCA外，SOM同樣也可應(yīng)用于包括基因組和轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)研究中［23］。最初SOM計(jì)算時(shí)間長(zhǎng)，依靠數(shù)據(jù)輸入順序決定聚類結(jié)果，近年來(lái)SOM逐漸發(fā)展成為不受數(shù)據(jù)錄入順序影響的批次自組織映射圖法(BLSOM)。由于BLSOM可以對(duì)類進(jìn)行調(diào)整，且有明確的分類標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化次序優(yōu)于其他聚類法，已在基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析中得到廣泛的應(yīng)用。
2.4其他數(shù)據(jù)采礦方法
除PCA、HCA和SOM外，很多變量分析方法都可用于植物代謝組學(xué)的分析。軟獨(dú)立建模分類法(SIMCA)是利用主成分模型對(duì)未知樣品進(jìn)行分類和預(yù)測(cè)，適合對(duì)大量樣本進(jìn)行分析；近鄰分類法(KNN)和K平均值聚類分析法(KMN)也可用于樣品分類；主成分回歸法(PCR)或偏最小二乘回歸法(PLS)在某些情況下也可使用。然而到目前為止由于還沒(méi)有建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)分析方法，代謝組學(xué)仍然是一門有待完善的學(xué)科。
3代謝組學(xué)在藥用植物中的實(shí)踐
植物藥材來(lái)源于藥用植物體，而藥用植物體的形態(tài)建成是其體內(nèi)一系列生理、生化代謝活動(dòng)的結(jié)果。植物代謝活動(dòng)分為初生代謝和次生代謝，初生代謝在植物生命過(guò)程中始終都在發(fā)生，其通過(guò)光合作用、檸檬酸循環(huán)等途徑，為次生代謝的發(fā)生提供能量和一些小分子化合物原料。次生代謝往往發(fā)生在植物生命過(guò)程中的某一階段，其主要生物合成途徑有莽草酸途徑、多酮途徑和甲瓦龍酸途徑等。植物藥材含有的生物堿、胺類、萜類、黃酮類、醌類、皂苷、強(qiáng)心苷等活性物質(zhì)的絕大多數(shù)屬于次生代謝產(chǎn)物，因此探討次生代謝產(chǎn)物在藥用植物體內(nèi)的合成積累機(jī)制及其影響因素，對(duì)于提高活性物質(zhì)含量、保證藥材質(zhì)量、穩(wěn)定臨床療效等具有重要意義。孫視等［24］通過(guò)對(duì)銀杏葉中黃酮類成分積累規(guī)律的研究，提出了選擇具有一定環(huán)境壓力的次適宜生態(tài)環(huán)境解決藥用植物栽培中生長(zhǎng)和次生產(chǎn)物積累的矛盾。王昆等［25］以人參葉組織為材料,總結(jié)了構(gòu)建人參葉cDNA文庫(kù)過(guò)程中存在的一些關(guān)鍵問(wèn)題和應(yīng)采取的對(duì)策,為今后關(guān)于人參有效成分如人參皂苷的生物合成途徑及其調(diào)控的基礎(chǔ)研究提供技術(shù)參考和理論指導(dǎo)。最近，美國(guó)加利福尼亞大學(xué)伯克利分校的Keasling等［26］采用一系列的轉(zhuǎn)基因調(diào)控方法，通過(guò)基因工程酵母合成了青蒿素的前體物質(zhì)——青蒿酸，其產(chǎn)量超過(guò)100mg/L，為有效降低抗瘧藥物的成本提供了機(jī)遇。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究積累，人們對(duì)代謝途徑的主干部分（為次生代謝提供底物的初生代謝途徑）已經(jīng)基本了解，例如酚類的莽草酸途徑，萜類的異戊二烯二磷酸(IPP)途徑等。被子植物中一些相對(duì)保守的次生代謝途徑也得到了很好的研究，如黃酮類、木質(zhì)素的生物合成與調(diào)控。然而，對(duì)次生代謝最豐富最神奇的部分——特定產(chǎn)物合成與積累的過(guò)程，還所知甚少［27］。
4展望
近年來(lái)，代謝組學(xué)正日益成為研究的熱點(diǎn)，越來(lái)越多的人已加入到代謝組學(xué)的研究中。隨著代謝組學(xué)積累的數(shù)據(jù)和信息量的增大，其在藥用植物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值也與日俱增。它將不僅能對(duì)單個(gè)代謝物進(jìn)行全方面的分析，更能尋找其代謝過(guò)程中的關(guān)鍵基因、通過(guò)代謝指紋分析對(duì)藥用植物進(jìn)行快速分類、進(jìn)一步研究藥用植物有效成分代謝途徑以及環(huán)境因子對(duì)植物代謝和品質(zhì)的影響與調(diào)控機(jī)制。
然而依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的指導(dǎo)思想，目前急待解決的是中藥種質(zhì)資源的代謝組學(xué)研究和中藥體內(nèi)作用的代謝組學(xué)研究。同時(shí)，代謝組學(xué)在分析平臺(tái)技術(shù)、方法學(xué)手段和應(yīng)用策略等方面相對(duì)于其他組學(xué)技術(shù)還需要進(jìn)一步發(fā)展和完善，還需要其他學(xué)科的配合和介入。相信隨著更有力的成分分析設(shè)備的使用及代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，藥用植物代謝組學(xué)將對(duì)中醫(yī)藥學(xué)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。
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