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【關(guān)鍵詞】再灌注損傷

Changesofnitricoxidesynthesisincardiacischemiareperfusioninjury

【Abstract】AIM:Toinvestigatetheexpressionandfunctionofendothelialnitricoxidesynthase(eNOS)andinducibleNOS(iNOS)duringischemiareperfusioninjury(IRI)inrathearts.METHODS:IRIwasinducedbyclampingtheleftanteriordescending(LAD)ofcoronaryarteryfor1h,followedbyreperfusion.Nitricoxidesynthase(NOS)activitiesofheartswasassayedatvarioustimepointsandNOSproteinlevelsaswellasNOSmRNAexpressionweredeterminedbyWesternblotandRTPCRmethodsrespectively.RESULTS:eNOSactivity,proteinlevelandmRNAexpressionallincreasedafter26hofIRIanddecreasedafter3dofIRIandthengraduallyreturnedtobasallevelafter21d.iNOSwasexpressedafter12hofIRIandreachedthepeaklevelatday3afterIRIandthendecreasedtobasallevel.CONCLUSION:TheexpressionofiNOSishighwhilethatofeNOSislowduringcardiacischemiareperfusioninjury.ProperregulationofeNOSandiNOSexpressionmaybetherapeuticallyhelpfulintreatingpatientswithcardiacischemiareperfusioninjury.

【Keywords】reperfusioninjury;nitricoxidesynthase;heart

【摘要】目的：研究大鼠心臟缺血再灌注損傷(IRI)過程中一氧化氮合酶(NOS)的變化規(guī)律及其作用.方法：制作SD大鼠心臟IRI動物模型,用同位素法測定正常及IRI心組織的NOS活性；用Western印跡和逆轉(zhuǎn)錄PCR法分析eNOS和iNOS在IRI過程中蛋白和基因表達的變化.結(jié)果：心臟eNOS活性、蛋白和mRNA表達水平，在缺血再灌注2~6h后均增高，3天后降低，21天后逐漸恢復(fù)到正常水平.心臟iNOS活性、蛋白和mRNA表達水平，在缺血再灌注12h后開始表達，3天達高峰，然后逐漸降至正常水平.結(jié)論：單純?nèi)毖⒉灰餘OS活性的明顯變化,再灌注損傷使NOS的mRNA表達增加,酶的合成增多,活性增高.

【關(guān)鍵詞】再灌注損傷；一氧化氮合酶；心臟

0引言

一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)在心肌缺血再灌注中起著極其重要的作用［1］.一氧化氮合酶(nitricoxidesynthesis,NOS)可分為原生型(cNOS)和誘生型(iNOS).cNOS依存在的部位分為神經(jīng)型(nNOS)和內(nèi)皮型(eNOS).心臟組織內(nèi)的NOS同功酶有兩種,即eNOS和iNOS.參與炎性反應(yīng)及急性排斥反應(yīng)等病理過程［2］.我們研究eNOS和iNOS在心臟IRI中的變化規(guī)律及其作用,為其防治提供理論基礎(chǔ).

1材料和方法

1.1材料

SD大鼠購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心；iNOSAssayKit購自南京建成生物技術(shù)研究所；一抗羊抗大鼠iNOS或eNOSmAb購自武漢博士德公司；HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG二抗購自Sigma公司；Trizol裂解液、Oligo(dT)、TaqDNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶(AMVRT)均為美國Gibco公司產(chǎn)品；eNOS和iNOS引物及內(nèi)參照由上海博亞生物技術(shù)公司合成.冠狀動脈阻斷再灌注模型制備［3］后在不同的再灌注時間點處死大鼠,收集心臟標(biāo)本,液氮急凍,-70℃保存?zhèn)溆?

1.2方法

取雄性200～220gSD大鼠120只,隨機分為缺血再灌注（IRI）組和假手術(shù)（對照,Control）組，每組60只，在再灌注不同時間點（0,0.5,1,2,6,12h和1,3,7,14,21,30d）處死大鼠，每組每個時間點各5只.

1.2.1NOS活性的測定IRI組大鼠取左室缺血區(qū)心肌0.2g,對照組大鼠取左室相應(yīng)區(qū)心肌0.2g,采用iNOSAssayKit進行測定.心組織NOS活性的測定采用3［H］精氨酸同位素法［4］,心組織在4℃含有1mmol/Lleupeptin,2mmol/Laprotonin,1mmol/Lphenylemthylsulfonylfluoride,1mmol/LDTT,1ml/LTritonX100的30mmol/LHEPES緩沖液中勻漿,反應(yīng)液為30mmol/LHEPES緩沖液(pH7.4),含1mmol/LCaCl2,100mmol/LNADPH,300mmol/Ltetrahydrobiopterin,1mmol/Ldithiothreitol,以40mmol/LL3H精氨酸(37kBq/反應(yīng)液)為反應(yīng)底物,在37℃下反應(yīng)30min,用200μL含100mmol/LEGTA的終止液終止反應(yīng),反應(yīng)體系過5cm的Dowex離子交換層析柱,加閃爍液后讀取放射性記數(shù).蛋白定量用Bradford法,NOS活性用每克蛋白秒fmol（即fkat/g）表示.

1.2.2Western印記檢測iNOS和eNOS蛋白表達IRI組大鼠取左室缺血區(qū)心肌0.2g,對照組大鼠取左室相應(yīng)區(qū)心肌0.2g,以5∶1(V/m)比例置勻漿緩沖液（含50mmol/LTrispH7.5,150mmol/LNaCl,5g/Lαcholatesodium,1g/LSDS,2mmol/LEDTA,10g/LTritonX100,100mL/L甘油，1mmol/LPMSF,2mg/Laprotinin）勻漿破碎組織.勻漿液于4℃10000g離心15min，收集上清液并用dyebinding(BioRad)方法以牛血清清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)測定蛋白濃度.取含30mg總蛋白的各組標(biāo)本勻漿上清液點樣進行75g/LSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離Mr135000的iNOS及150000的eNOS蛋白.Mr標(biāo)準(zhǔn)采用預(yù)染的彩虹重組蛋白(AmershamInternationalplc,Buckinghamshire,England).電泳后的凝膠通過Western印記裝置（BioRad）電轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至hybondC膜(AmershamPharmaciaBiotech,Buckinghamshire,England).轉(zhuǎn)移膜經(jīng)封閉、與1∶500稀釋的iNOS或eNOSmAb4℃孵育過夜、洗滌、與1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG室溫孵育1h和第2次洗滌，最后用ECLWestern印記熒光檢測系統(tǒng)(AmershamLifeSciences,ArlingtonHeights,IL)顯色、曝光于X光底片(Fuji,Tokyo,Japan)和顯影、定影.將感光X光片上蛋白條帶應(yīng)用HPIAS2000型圖像分析系統(tǒng)(同濟千屏影像工程公司生產(chǎn))掃描測定光密度(OD)定量.

1.2.3RTPCR檢測iNOS和eNOS的轉(zhuǎn)錄IRI組大鼠取左室缺血區(qū)心肌0.2g,對照組大鼠取左室相應(yīng)區(qū)心肌0.2g,采用Trizol試劑提取總RNA，以thermoscriptTMRTPCR系統(tǒng)進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng).PCR反應(yīng)采取等量逆轉(zhuǎn)錄cDNA模板，分別以iNOS,eNOS,βactin特異性引物進行PCR反應(yīng).擴增iNOS的引物對為：sense：5′TGGCTTGCCCTTGGAAGTTT

CTC3′,antisense:5′TCCAGGCCATCTTGGTGGCAAGA3′，預(yù)計擴增產(chǎn)物為574bpiNOScDN段，PCR反應(yīng)條件為95℃5min；95℃30s，60℃45s，72℃1min，共30個循環(huán)；72℃10min.擴增eNOS的引物對為：sense:5′TACGGAGCAGCAAATCCAC3′,antisense:5′CAGGCTGCAGTCCTTTGATC3′，預(yù)計擴增產(chǎn)物812bp，PCR反應(yīng)條件為95℃5min；95℃45s，60℃45s，72℃1.25min，共30個循環(huán)；72℃10min.內(nèi)對照βactin的擴增引物對為：sense:5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′,antisense:5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′，預(yù)計產(chǎn)物為540bp，PCR反應(yīng)條件為95℃2min；95℃30s，60℃45s，72℃1min，共30個循環(huán)；72℃10min.PCR產(chǎn)物以含0.5mg/L溴乙錠的10g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外光照下觀察電泳條帶,用BioRad凝膠分析系統(tǒng)分析結(jié)果，結(jié)果以光密度值（OD）表示.

統(tǒng)計學(xué)處理:數(shù)據(jù)均以x±s表示.應(yīng)用SPSS11.0軟件進行方差分析,P<0.05為有顯著性差異.

2結(jié)果

2.1心臟IRI時NOS活性的變化單純?nèi)毖?h，心臟NOS活性與對照組相比無明顯變化.心臟恢復(fù)血供再灌注0.5h后cNOS活性即開始升高,以2～6h最高,與對照組相比,差異有顯著性意義(P<0.01)；但12h后卻迅速下降,3d時活性最低與對照組相比,差異有顯著性意義(P<0.01),以后逐日恢復(fù),21d時心恢復(fù)正常.iNOS活性在對照組心臟表達微弱,再灌注2h后逐漸升高,12h~3d活性達高峰,與對照組相比差異有顯著性意義(P<0.01),以后逐漸下降,7d后基本恢復(fù)正常(Tab1).表1心臟IRI后cNOS和iNOS的活性變化（略）

2.2Western印跡IRI組再灌注0.5h后心臟eNOS蛋白質(zhì)表達即開始升高,2h達到高峰,12h后開始減少,3d時為最低,以后逐漸恢復(fù),21d時恢復(fù)至對照組水平,與NOS活性變化相一致.對照組心臟檢測出iNOS蛋白微量表達,但表達量遠低于eNOS,IRI可誘導(dǎo)其表達,在12h后表達逐漸增強,3d時表達最強,隨后逐漸減弱,21d時恢復(fù)對照組水平,也與iNOS的活性變化相一致(Fig1,Tab2).表2Western印跡法測定心臟IRI后eNOS和iNOS蛋白表達(略)

2.3NOSmRNA的基因表達IRI組心臟再灌注早期(0.5～12h)即可誘導(dǎo)eNOSmRNA表達增強,2h達高峰,此后隨著損傷程度加重,其表達迅速下降.3d低于對照組,以后逐步恢復(fù),21d已相當(dāng)對照組水平.在對照組心臟iNOSmRNA表達微弱,再灌注12h后開始增強,3d達高峰,21d恢復(fù)正常水平(Fig2,Tab3).以上eNOS和iNOSmRNA的消長變化與蛋白質(zhì)的表達和酶活力的變化一致.表3大鼠心臟IRI后eNOS和iNOSmRNA半定量結(jié)果(略)

3討論

eNOS來源的NO具有舒張心血管,抑制白細胞浸潤和血小板的凝聚作用［5］，從而對心臟可能起到保護作用.Song等［6］的研究表明,在早期eNOS的過量表達對小鼠骨骼肌的IRI具有保護作用,隨著損傷過程的進展,心臟結(jié)構(gòu)和功能的損害不斷加重,eNOS表達也相應(yīng)迅速下降.這可能由于大量心肌細胞壞死和凋亡,導(dǎo)致eNOS的合成減少有關(guān).eNOS的表達隨著心臟損傷修復(fù)和心功能的恢復(fù)逐步恢復(fù).NO在心肌再灌注損傷中加重心肌損害.缺血再灌注情況下,多種細胞因子上調(diào)巨噬細胞等內(nèi)的iNOS的mRNA表達,立即產(chǎn)生大量的iNOS和NO.過量的NO與氧迅速反應(yīng)生成大量的氧自由基如過氧亞硝酸陰離子(ONOO),后者可進一步反應(yīng)生成HO-,NO2,NO3-等,其結(jié)果是引起和加重心肌缺血再灌注損傷［7］.

我們發(fā)現(xiàn)，單純?nèi)毖?h對心臟NOS活性無明顯影響,再灌注30min后NOS活性即開始升高,2～6h到達高峰,持續(xù)到6h，此后迅速下降,24h降低到正常以下,21d時恢復(fù)至正常水平.RTPCR分析發(fā)現(xiàn)eNOS及iNOSmRNA的變化與其蛋白變化相一致.可見在IRI中,早期eNOS的高表達可能參與了早期心血流的調(diào)節(jié),對抑制心血管痙攣、減少炎性細胞的浸潤有關(guān)；iNOS參與介導(dǎo)了心臟IRI的炎癥損傷.可以設(shè)想,在器官保存過程中或移植后早期使用iNOS的抑制劑,將會減少急性心肌壞死和凋亡以及急性排斥反應(yīng)的發(fā)生,對IRI起到保護作用,促進心功能的恢復(fù)，為臨床提供科學(xué)的理論依據(jù).

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