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關(guān)鍵詞：軟骨細(xì)胞

自從1965年chestman和Smith首先開始軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)用于軟骨缺損修復(fù)的研究以來［1］，人們開始對關(guān)節(jié)軟骨損傷不能通過自身的軟骨增殖修復(fù)的概念有了新的認(rèn)識。實驗證明不僅年幼且年老的關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本仍可在體外培養(yǎng)出新生透明軟骨［2］。雖然軟骨細(xì)胞增殖能力有限，其質(zhì)與量直接影響體外培養(yǎng)擴增效果，軟骨細(xì)胞生長環(huán)境不同所表現(xiàn)出的生物學(xué)特性也有差別。軟骨細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)或半固體瓊脂培養(yǎng)基中生長良好并保持表型穩(wěn)定，在培養(yǎng)瓶底水凝膠覆蓋的四維培養(yǎng)環(huán)境中長期培養(yǎng)時軟骨細(xì)胞可形成結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)其細(xì)胞形態(tài)胞外基質(zhì)分泌和軟骨特異性基因表達(dá)皆與關(guān)節(jié)軟骨相似。軟骨細(xì)胞的生長密度對其生長也至關(guān)重要。在同樣的條件下體外單層培養(yǎng)時，由于細(xì)胞密度不同，軟骨細(xì)胞的生長分裂經(jīng)過和形態(tài)功能完全不同。組織學(xué)檢查表明，細(xì)胞形態(tài)不同，其堿性磷酸酶活性、細(xì)胞分泌特異性基質(zhì)的功能及對細(xì)胞作用因子的反應(yīng)也不同，進(jìn)一步研究表明，軟骨細(xì)胞靠自分泌或旁分泌信號的方式而存活。

1細(xì)胞因子對體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的影響

軟骨細(xì)胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制軟骨細(xì)胞單層培養(yǎng)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損及體外大量擴增的因素之一，隨著細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)特異基因表達(dá)的研究日益深入，細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖、分化過程漸被人們所揭示，這對軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)研究又提出了一個新方向。近年來，關(guān)于細(xì)胞因子等多肽蛋白質(zhì)對軟骨細(xì)胞體外增殖分化等的影響研究也較多。也有些學(xué)者發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞內(nèi)含許多細(xì)胞因子及其受體，且表明許多細(xì)胞因子通過自分泌或旁分泌兩種基本方式來調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞。目前認(rèn)為促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和基質(zhì)合成代謝的細(xì)胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，對軟骨細(xì)胞有抑制作用的有IL-1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等，現(xiàn)就對軟骨細(xì)胞有顯著調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子分述如下：

1.1轉(zhuǎn)化生長因子beta(TGF-β)

TGF-β最初是由Robert等學(xué)者在1978年作為一種可誘導(dǎo)大鼠成纖維細(xì)胞增殖因子而描述。TGF-β可以誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞?，F(xiàn)已實驗證明TGF-βs具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)其分化和胞外基質(zhì)合成的能力［3］。F.Redni等實驗證明培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表達(dá)了不同的TGFβ受體且與軟骨細(xì)胞生長周期功能有關(guān)，軟骨細(xì)胞在S期表現(xiàn)了低親和力受體表型(kd=appiox1100pm)然而GO/G期的軟骨細(xì)胞表現(xiàn)了高親和力受體。因此，TGF-β對軟骨細(xì)胞的作用有多種受體參與。同時也有實驗證明TGF-β更多的結(jié)合在GO/G1期比S期的同步化軟骨細(xì)胞，從而說明TGF-βs對軟骨細(xì)胞的作用是通過不同的途徑［4］。也有學(xué)者證明TGF-βs在不同的條件下對成軟骨細(xì)胞有促進(jìn)分化或降低分化的雙重作用，1-10ng/ml濃度的TGF-β可誘導(dǎo)大鼠胚胎肌細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞，合成特異性的Ⅱ型膠原和蛋白多糖，而在0.4mol/L濃度下，TGF-β可誘導(dǎo)大鼠顱骨成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，減少軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原、蛋白多糖的合成［5］。同時也有實驗證明TGF-β可抑制培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的終末分化及鈣化。TGF-β可能與多種因素如胞外基質(zhì)和其它分化調(diào)控生長因子參與對細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用［6］。TGF-β在細(xì)胞對其它各種分化信號的應(yīng)答過程中同樣也有調(diào)節(jié)作用。Wen-NingQi等實驗證明Ⅱ型膠原能特異的調(diào)節(jié)TGF-β刺激軟骨細(xì)胞合成Ⅱ型前膠原DNA和蛋白多糖，同時說明Ⅱ型膠原在TGF-β存在的條件下調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)具有劑量依賴性(量效關(guān)系)。因此Ⅱ型膠原基因表達(dá)的變化在TGF存在條件下受Ⅱ型膠原的調(diào)控［7，8］。

體外實驗證明，許多細(xì)胞因子對軟骨細(xì)胞有協(xié)同或拮抗作用如TGF-βs、IGFs、FGF、BMP、IL-1等，兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)時，TGF-β對IGF的分泌作用有三種，(1)減少41KD的IGFBP；(2)增加IGF受體的結(jié)合位點；(3)下調(diào)了誘導(dǎo)型IGF-1受體的自身磷酸化［9］，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和特異性基質(zhì)的合成。也有學(xué)者認(rèn)為TGF-β和IGF可以使反分化的軟骨細(xì)胞再分化誘導(dǎo)和持久表達(dá)Ⅱ型膠原和蛋白多糖［10］。軟骨細(xì)胞在傳代培養(yǎng)中表型的變化可能與軟骨細(xì)胞自分泌IL-1有關(guān)，而TGFβ可作為一種IL-1的拮抗劑，減少了IL-1對胞外基質(zhì)的分解代謝同時也下調(diào)了IL-1受體及其金屬蛋白酶的表達(dá)［11］。TGFβ可能通過以下兩種途徑拮抗IL-1的作用，(1)刺激成軟骨細(xì)胞中蛋白糖抑制劑的產(chǎn)生。(2)抑制軟骨細(xì)胞蛋白酶的產(chǎn)生，因而對細(xì)胞外基質(zhì)的合成有促進(jìn)作用［12］。

1.2骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)

BMP是TGFβ的超家族成員之一，BMP-7(OP-1)是BMP家族中的一員，其對無血清培養(yǎng)的高密度單層細(xì)胞和懸浮在瓊脂糖中的細(xì)胞有促進(jìn)生長和成熟作用，可增加其堿性磷酸酶活性和提高mRNA和Ⅱ型膠原的合成能力。實驗rhBMP(OP-1)能有效促進(jìn)胚胎和成人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成蛋白多糖和Ⅱ型膠原而Ⅰ、Ⅲ型膠原沒有增加。也有實驗證明OP-1對人軟骨細(xì)胞特異性膠原、蛋白多糖的促合成作用比IGF-Ⅰ、TGF-β和激活素更顯著［13］。在培養(yǎng)軟骨細(xì)胞生長周期的不同時期，BMP的作用也不同，rhBMP調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖、分化作用依賴于細(xì)胞的成熟狀態(tài)，且靜止區(qū)軟骨細(xì)胞更敏感，同時對軟骨細(xì)胞的自分泌也有作用［14］。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)時表達(dá)了BMP-4功能性受體。1998年Rach1,venena等實驗證明BMP2和維生素C共同作用下培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞沒有誘導(dǎo)其肥大，同時BMP-2獨自干預(yù)下細(xì)胞凋亡明顯少于維生素C的干預(yù)，從而說明軟骨細(xì)胞向肥大軟骨細(xì)胞的過度與細(xì)胞增殖數(shù)量減少而相對高的凋亡水平有關(guān)。軟骨細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)漸反分化為成纖維樣細(xì)胞或過度為肥大軟骨細(xì)胞與細(xì)胞生存的微環(huán)境有關(guān)［15］。

1.3胰島素樣生長因子(IGFs)

IGF于1953年由salmon和Danghaday研究表明，IGFs家族由兩種相關(guān)多肽組成即IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ。在軟骨細(xì)胞表面有IGF的受體且軟骨細(xì)胞能合成和分泌這種多肽。IGF-Ⅰ能與軟骨細(xì)胞膜上的受體結(jié)合也以旁分泌和自分泌的方式起作用。IGF-Ⅰ能強烈刺激軟骨細(xì)胞合成Ⅱ型膠原和蛋白多糖，IGF-Ⅰ還能刺激軟骨細(xì)胞集落形成和細(xì)胞增殖，體內(nèi)IGF-Ⅰ能促進(jìn)骨骺軟骨生長。而IGF-Ⅱ能刺激軟骨細(xì)胞DNA和RNA的合成且比IGF-Ⅰ更有效的刺激胚胎細(xì)胞的生長。但I(xiàn)GF-Ⅰ對成年軟骨細(xì)胞的作用強于IGF-Ⅱ，也能促進(jìn)蛋白多糖的合成。軟骨細(xì)胞表面的IGF-Ⅱ的受體與IGF-Ⅰ相比，兩者的結(jié)構(gòu)與體外活性相似，但體內(nèi)生物效應(yīng)不同。而IGF結(jié)合蛋白(IGF1BPs)它通過特異性結(jié)合IGFs而起作用，盡管目前對IGFBPs的生理功能還不十分清楚，但它們對IGFs的調(diào)節(jié)作用是肯定的，它們通過結(jié)合IGFs減少了IGFs與其受體的相互作用，從而降低了IGFs的活性。onley等人實驗表明細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)IGFBPs的產(chǎn)生，IGFBPs反過來調(diào)節(jié)IGF的作用，同時表明IL-1α、TNF-α降低細(xì)胞對IGF-Ⅰ的反應(yīng)性可能是通過增加IGFBPs而起作用。

1.4成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)

FGFs最初是從牛腦垂體分離出來的一種蛋白質(zhì)，后來發(fā)現(xiàn)它在人體組織包括骨、軟骨基質(zhì)中廣泛存在，且對胚胎發(fā)育及軟骨修復(fù)起重要作用。體外實驗發(fā)現(xiàn)它能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖、成熟和胞外基質(zhì)的合成，而bFGF是一種強大的軟骨細(xì)胞有絲分裂原，它能刺激生長板中軟骨細(xì)胞蛋白多糖的合成。在成人關(guān)節(jié)軟骨中它與IGF有協(xié)同作用，兩者協(xié)同刺激軟骨細(xì)胞有絲分裂和蛋白多糖的合成，抑制軟骨細(xì)胞分化為肥大表型。

1.5白介素和腫瘤壞死因子(IL、TNF)

近來報道IL-1對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝的干預(yù)作用主要表現(xiàn)為抑制透明軟骨特征性Ⅱ、Ⅳ型膠原的合成，而促進(jìn)Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成使軟骨細(xì)胞變性，抑制軟骨細(xì)胞增殖和蛋白多糖的合成同時IL-1對關(guān)節(jié)軟骨的降解作用主要表現(xiàn)在促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成和分泌金屬蛋白酶，并提高軟骨基質(zhì)中溶解蛋白分子酶類的活性。TNF是通過IL-1而抑制Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成，但其作用遠(yuǎn)弱于IL-1。

2力學(xué)刺激對培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的影響

關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞和胞外基質(zhì)組成，而胞外基質(zhì)主要包括膠原和蛋白多糖，其中Ⅱ型膠原占膠原的95%，聚合素是蛋白多糖的主要成分，關(guān)節(jié)運動時軟骨經(jīng)歷循環(huán)應(yīng)力載荷而發(fā)生周期性變形和恢復(fù)，循環(huán)載荷是軟骨細(xì)胞執(zhí)行正常功能和維持胞外基質(zhì)正常表型的基本因素。而體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞其隨傳代次數(shù)增加而發(fā)生代謝、表型的變化伴有Ⅱ、Ⅳ型膠原合成減少，Ⅰ、Ⅲ型膠原合成增加和蛋白多糖分子量的改變，為維持體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的正常形態(tài)和功能則許多學(xué)者進(jìn)行了軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的力學(xué)刺激實驗研究。這種壓力可分為兩種：一種是持續(xù)靜壓力，一種是循環(huán)動壓力，力學(xué)刺激對調(diào)控軟骨代謝和維持其胞外基質(zhì)正常表型起重要作用，其中靜壓力刺激減少了Ⅱ膠原和蛋白多糖的合成，而正常動壓力刺激則促進(jìn)Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成［16，17］，K.Koarninnta［18］實驗表明持續(xù)高流體靜壓力抑制蛋白多糖的合成和分泌，減少了聚合素mRNA的表達(dá)，改變了高爾基氏器的形態(tài)和抑制微絲的組成。在循環(huán)壓力作用下軟骨組織內(nèi)4種物理特性發(fā)生變化；①靜水壓；②毛細(xì)液流；③流能；④組織與細(xì)胞變形。低頻循環(huán)壓力促進(jìn)基質(zhì)降解而高頻循環(huán)壓力則促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成代謝。所以力學(xué)刺激是軟骨細(xì)胞的一個重要調(diào)節(jié)者，但軟骨細(xì)胞又如何接受力學(xué)刺激信號呢自從認(rèn)識軟骨細(xì)胞可以分泌整合素以來，整合素就在軟骨細(xì)胞與胞外基質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起著重要作用。整合素是一種異二聚體(α、β)轉(zhuǎn)膜糖蛋白特異性受體，力學(xué)刺激使胞外基質(zhì)與整合素結(jié)合同時與細(xì)胞骨架相連，從而影響著基因表達(dá)和調(diào)控細(xì)胞生長和分化［19，20］。力學(xué)刺激促進(jìn)膠原合成增加同時整合素合成也上調(diào)，力學(xué)刺激增加了α2整事素亞單位mRNA表達(dá)。實驗表明在軟骨細(xì)胞培養(yǎng)一周后，給予循環(huán)壓力刺激15次/min，結(jié)果3h后，循環(huán)壓力促進(jìn)了Ⅱ型膠原和聚合素mRNA的表達(dá)，從而說明胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)整合素來應(yīng)答力學(xué)刺激。α2β1整合素是Ⅱ型膠原受體。軟骨基質(zhì)受體作為一種應(yīng)力感受器在軟骨基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中通過力學(xué)刺激信號來調(diào)控軟骨細(xì)胞。周期性力學(xué)刺激促進(jìn)基質(zhì)合成，而靜壓力則促進(jìn)基質(zhì)合成減少［21，22］，所以力學(xué)刺激信號可能通過力學(xué)刺激、細(xì)胞外基質(zhì)、整合素、細(xì)胞骨架(肌動蛋白)而調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖和分化功能。Takahaki-k［23］等實驗證鞒咚降木菜褂盞糏L－6和TNF-αmRNA表達(dá)增加而縮減了蛋白多糖核心蛋白的表達(dá)，生理水平的靜水壓則增加了蛋白多糖核心蛋白的表達(dá)，組織與細(xì)胞變形可興奮ECM受體［24］細(xì)胞膜張力受體、細(xì)胞網(wǎng)架結(jié)構(gòu)［25］而促進(jìn)合成功能，總之，機構(gòu)壓力對培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的作用在有效范圍內(nèi)與壓力值無關(guān)，而與壓縮程度(靜壓力)和頻率(循環(huán)壓力)有關(guān)，持續(xù)的靜壓力抑制軟骨細(xì)胞的合成代謝，一定頻率的循環(huán)壓力則促進(jìn)軟骨細(xì)胞的合成功能［26］。

3其它因素對培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的影響

體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞隨其傳代而表型整個發(fā)生改變，正常的Ⅱ、Ⅳ型膠原合成減少，Ⅰ、Ⅲ型膠原合成增加，在不同的培養(yǎng)條件下(如培養(yǎng)基、PH細(xì)胞的接種密度、血清濃度、氧分壓及其培養(yǎng)基的離子濃度、培養(yǎng)方式)其表型不同，有時可以反分化或向肥大軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。體外培養(yǎng)只有保持其正常形態(tài)才能保持其正常功能。Freed［27］等將軟骨細(xì)胞移植于DGA、PLA進(jìn)行三維體外培養(yǎng)，證明三維培養(yǎng)6周后其細(xì)胞數(shù)擴增了近8.3倍，且傳代后細(xì)胞產(chǎn)生蛋白多糖和Ⅱ型膠原的能力較佳，所以軟骨細(xì)胞三維培養(yǎng)有利于維持其形狀，常利用膠原纖維蛋白、瓊脂、海澡酸鹽、PGA、PLA等為附屬物進(jìn)行三維培養(yǎng)。也有學(xué)者認(rèn)為無血清培養(yǎng)可以阻止軟骨細(xì)胞反分化。培養(yǎng)基PH值輕度偏堿不利于蛋白多糖的合成，偏酸則相反。低鈣環(huán)境有利于軟骨細(xì)胞的穩(wěn)定［28］。1995年Baragi［29］等將IL-Rα和標(biāo)記基因LacZ分別構(gòu)建在腺病毒上轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞并將它們分別與骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織塊一起培養(yǎng)，結(jié)果表明與IL-1Rα轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的組織塊能抵制IL-1β的作用而與LacZ細(xì)胞培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞塊抵制作用明顯減弱，從而說明基因轉(zhuǎn)染可以用來調(diào)控軟骨細(xì)胞從而維持其表型。

4結(jié)束語

體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的優(yōu)點是可以大量擴增及研究其生命活動的狀況，但要維持其正常表型則受到眾多復(fù)雜因素的調(diào)控。就其細(xì)胞因子而言，細(xì)胞因子對體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的作用非單一的，而是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)作用，如生長因子的生物學(xué)活性是由受體介導(dǎo)的，生長因子在軟骨細(xì)胞合成分泌后，多為無活性的前體分子需要經(jīng)過特異性的激活才能發(fā)揮作用。生長因子之間存在基因表達(dá)及其活性的相互調(diào)控TGF-β能促進(jìn)PDGF的A鏈和B鏈的mRNA表達(dá)和分泌［30］。bFGF能促進(jìn)TGF-βmRNA的表達(dá)，誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞，增強TGF對軟骨細(xì)胞的增殖及其基質(zhì)合成作用。生長因子之間還存在受體水平的調(diào)控，胰島素不影響TGF-Ⅱ型受體的親和力但增加了Ⅱ型受體的數(shù)目引起受體上調(diào)效應(yīng)，從而Ⅱ型受體與Ⅰ型受體競爭，使胰島素與Ⅰ型受體結(jié)合減少。IL-1可使TNF受體下調(diào)，而IFN-γ卻使TNF受體上調(diào)等。但是網(wǎng)絡(luò)生長因子如何調(diào)控體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的增殖、分化阻滯反分化或向肥大型轉(zhuǎn)化、維持其正常軟骨細(xì)胞表型及合成特異性胞外基質(zhì)還需進(jìn)一步的研究?？傊浌羌?xì)胞體外培養(yǎng)維持其正常表型則受到眾多因素的影響如培養(yǎng)條件及其方式，細(xì)胞的微環(huán)境，PH值、細(xì)胞密度、力學(xué)變化、生長因子等等。隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)大量擴增、分化維持其正常的表型及代謝的調(diào)控因素會漸為人們所明晰，為組織工程化軟骨修復(fù)軟骨缺損、體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞建立軟骨細(xì)胞庫(永生化軟骨細(xì)胞)及揭示退變性骨關(guān)節(jié)病又開拓了一條新的途徑。

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