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青霉素的發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)由病原微生物感染而引發(fā)的各類疾病不再束手無策,并由此發(fā)展了大量的β-內(nèi)酰胺類抗生素,對(duì)保護(hù)人類健康作出了巨大貢獻(xiàn)。但隨著上述“傳統(tǒng)抗生素”的廣泛使用,不斷產(chǎn)生出諸多新問題。如β-內(nèi)酰胺類抗生素的過敏反應(yīng)以及長期使用導(dǎo)致抗藥菌株的產(chǎn)生。于是人們開始尋找新一代抗菌劑。近期的研究發(fā)現(xiàn),某些陽離子型多肽具有廣譜的抗菌活性,同時(shí)具有“傳統(tǒng)抗生素”無法比擬的優(yōu)越性:不會(huì)誘導(dǎo)抗藥菌株的產(chǎn)生,有希望成為新一代抗菌劑[1]。

抗菌肽(antimicrobialpeptides)是具有抗菌活性短肽的總稱。1975年瑞典科學(xué)家G.Boman等人[2]等從惜古比天蠶(Hyatophoracecropia)蛹中誘導(dǎo)分離得到一種殺菌肽,并將其命名為cecropin。此后,許多抗菌肽相繼被分離、純化。一些抗菌肽的氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)和基因序列得到確定。80年代,有關(guān)抗菌肽的研究主要集中在大型的經(jīng)濟(jì)昆蟲。90年代以來,在繼續(xù)對(duì)大型經(jīng)濟(jì)昆蟲進(jìn)行研究的同時(shí),又?jǐn)U展到一些小型昆蟲和其它無脊椎及脊椎動(dòng)物,抗菌肽已成為免疫學(xué)和分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。研究的內(nèi)容包括:抗菌肽的分離與純化,氨基酸序列的分析,蛋白質(zhì)構(gòu)型與功能的關(guān)系,抗菌肽的作用機(jī)理[3,4],應(yīng)用基因工程克隆與表達(dá)抗菌肽基因,改造合成抗菌肽基因以及動(dòng)植物的轉(zhuǎn)抗菌肽基因工程等,其中昆蟲抗菌肽基因工程研究最受重視[5,6]。目前已發(fā)現(xiàn)抗菌肽或類似抗菌肽的小分子肽類廣泛存在于生物界,包括細(xì)菌、動(dòng)植物和人類。這種內(nèi)源性的抗菌肽經(jīng)誘導(dǎo)而合成,在機(jī)體抵抗病原的入侵方面起著重要的作用,更被認(rèn)為是缺乏特異性免疫功能生物的重要防御成分?？咕木哂袕V譜殺菌作用,大多數(shù)對(duì)革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的殺滅作用,有些則對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均起作用。對(duì)某些真菌、原生動(dòng)物,尤其對(duì)耐藥性細(xì)菌有殺滅作用,并能選擇殺傷腫瘤細(xì)胞,抑制乙型肝炎病毒的復(fù)制。

1.抗菌肽的分類

迄今為止從不同生物體內(nèi)誘導(dǎo)的抗菌肽已不下200種,僅從昆蟲體內(nèi)分離獲得的就多達(dá)170余種。根據(jù)抗菌肽的結(jié)構(gòu),可將其分為5類:(1)單鏈無半胱氨酸(Cys)的抗菌肽,或由無規(guī)則卷曲連接的兩段а-螺旋組成的肽。該類包括天蠶素Cecropins,Magainins等。Magainins最初是從非洲爪蟾的皮膚中發(fā)現(xiàn)的,它是爪蟾的皮膚在一定的環(huán)境壓力下分泌出的抗感染和促進(jìn)傷口愈合的成分,由兩個(gè)緊密相連的肽鏈組成,每一個(gè)肽鏈有23個(gè)氨基酸,低濃度便可抑制許多細(xì)菌和真菌生長[7]。(2)富含某些氨基酸殘基但不含Cys的抗菌肽。如富含脯氨酸(Pro)或甘氨酸(Gly)殘基的抗菌肽。如從豬腸內(nèi)分離的抗菌肽PR39中Pro含量占49%[6]。鞘翅肽Coleoptericin和半翅肽Hemiptericin的全序中富含Gly[8]。(3)含一個(gè)二硫鍵的抗菌肽,該二硫鍵的位置通常在肽鏈C端。如爪蟾皮膚細(xì)胞中產(chǎn)生的Brevinins[9]。(4)有兩個(gè)或兩個(gè)以上二硫鍵,具有β折疊結(jié)構(gòu)的抗菌肽。如綠蠅防御素(Phormindefensin),分子內(nèi)有6個(gè)Cys形成3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵,肽鏈C末段是帶有擬β轉(zhuǎn)角的反向平行的β片層[10]。實(shí)驗(yàn)證明,分子中的二硫鍵在其抗菌作用中至關(guān)重要。(5)由其他已知功能較大的多肽衍生而來的具有抗菌活力的肽。

2.抗菌肽的作用及機(jī)理

2.1抗菌肽的抗菌作用及其機(jī)理抗菌肽分子可以在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜上穿孔而形成離子孔道,造成細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞,引起胞內(nèi)水溶性物質(zhì)大量滲出,而最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡?？咕姆肿邮紫冉Y(jié)合在質(zhì)膜上,接著其分子中的疏水段和兩親性α-螺旋也插入到質(zhì)膜中,最終通過膜內(nèi)分子間的相互位移,抗菌肽分子聚集形成離子性通道,使細(xì)菌失去了膜勢而死亡[10-14]。但是,Gazit[15]等得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,抗菌肽只是結(jié)合到了單位膜的表面上,并未插入膜中,更未形成通道。然而,抗菌肽的作用靶部位是細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜,以及抗菌肽的作用結(jié)果是導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜通透性增大等基本內(nèi)容是確切無疑的,這也正是抗菌肽與青霉素等傳統(tǒng)抗生素對(duì)細(xì)菌作用機(jī)制不同的本質(zhì)所在。

2.2抗菌肽的抗病毒作用及其機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)煙芽夜蛾幼蝦的血淋巴對(duì)6種DNA、RNA病毒有明顯的抑制作用,使病毒感染力迅速降低,而且這種抗病毒活性具有廣譜性。Mariam[16]試驗(yàn)表明來源于爪蟾的抗菌肽Magainins及其它Magainins類抗菌肽具有抗皰疹病毒-HSV的作用,還發(fā)現(xiàn)人的嗜中性粒細(xì)胞防御素(HNP-1)對(duì)一種皰疹病毒有抑制作用。此外,蜂毒素和天蠶素也可以在亞毒性濃度下抑制艾滋病毒HIV-1的基因表達(dá),從而抑制減少HIV-1的增殖。這表明抗菌肽對(duì)于當(dāng)今人類的頑癥———艾滋病也有抑制作用。

2.3抗菌肽的抗寄生蟲作用及其機(jī)理抗菌肽可以有效地殺滅產(chǎn)生人類及動(dòng)物寄生蟲病的寄生蟲,如瘧疾、Chagas氏病、萊什曼病等。目前發(fā)現(xiàn)一種合成的天蠶素-蜂毒素雜合體對(duì)萊什曼原鞭毛蟲有損傷作用,起作用的靶目標(biāo)是細(xì)胞質(zhì)膜,它可以快速降低H-OH的通透性,破壞膜電勢,質(zhì)膜形態(tài)也受到損壞。Shahabuddin[17]研究發(fā)現(xiàn)昆蟲抗菌肽對(duì)感染蚊子的瘧原蟲發(fā)育的不同時(shí)期有不同的作用,主要對(duì)瘧原蟲的卵囊期和子孢子期造成明顯的損傷。

2.4抗菌肽對(duì)腫瘤細(xì)胞作用及其機(jī)理國內(nèi)外已對(duì)抗菌肽殺傷腫瘤細(xì)胞的作用進(jìn)行了廣泛研究,發(fā)現(xiàn)抗菌肽對(duì)體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞的作用主要是使癌細(xì)胞膜上形成孔洞,內(nèi)容物外泄,線粒體出現(xiàn)空泡化,嵴脫落。核膜界限模糊不清,有的核膜破損,核染色體DNA斷裂,并抑制染色體DNA的合成,細(xì)胞骨架也受到一定程度的損傷[18,19]。通過對(duì)荷瘤小鼠的研究證明,抗菌肽能顯著抑制ECA腹水瘤荷瘤小鼠腹水的積累;對(duì)S180肉瘤和U14宮頸癌的抑瘤率亦達(dá)30%-50%[20]。抗菌肽還可以調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫機(jī)能,從體液免疫方面來抵抗癌瘤的入侵。

3.抗菌肽基因的融合表達(dá)

抗菌肽的天然產(chǎn)量低,合成或從機(jī)體中提取步驟復(fù)雜、產(chǎn)率低、價(jià)格相當(dāng)昂貴,利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗菌肽具有重要意義。抗菌肽所攜帶的堿性氨基酸使其對(duì)蛋白酶非常敏感,必須采用融合表達(dá)策略以抵消其堿性并降低其對(duì)宿主細(xì)胞的毒性。

謝維等合成了家蠶抗菌肽CMIV基因,并將其克隆到金黃色葡萄球菌A蛋白和IgG親合的結(jié)構(gòu)域ZZ的融合表達(dá)載體中,得到Pezz318-CMIVV質(zhì)粒,以此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliHB101,得到ZZ-CMIV融合表達(dá)的蛋白,用CBr切割后,得到CMIV肽。李秀蘭等[21]對(duì)天然抗菌肽CMIV的氨基酸序列作了50%的改動(dòng),根據(jù)E.coli偏愛的密碼子人工合成了肽基因片斷,重組到測序載體,再將此片斷重組到表達(dá)載體Pet28上進(jìn)行表達(dá),融合蛋白經(jīng)CNBr裂解后,具有與天然抗菌肽相同的生物活性。吳映雅等將柞蠶抗菌肽D基因連接在牛成纖維細(xì)胞生長因子cDNA的上游,在酵母中成功地得到了表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物具有抗菌活性和牛成纖維細(xì)胞生長因子的抗原性。Kevin等[22]HNP(humanneutrophilpeptide1)和CEME(syntheticcecropin/melittinhybrid)分別與GST(glutathione-S-transferase)、ORRF、IgG結(jié)合序列及SPA(staphylococcalproteinA)在E.coli或S.aureus中融合表達(dá),結(jié)果在S.aureus中雖實(shí)現(xiàn)了與SPA的融合分泌表達(dá),但表達(dá)產(chǎn)量較低;Zhang等[23]選擇RepA蛋白的序列作為抗菌肽的融合表達(dá)伴侶,并插入Histag等序列作為純化親和位點(diǎn),實(shí)現(xiàn)了在E.coli中的融合表達(dá)。ChristsnenB等研究中得到的融合抗菌肽的抗菌活性比其任何一個(gè)供體抗菌肽的活性都高。

4.抗菌肽轉(zhuǎn)基因研究

王志興等把大麥α-淀粉酶的信號(hào)肽序列和抗菌肽CecropinB基因或HhivaA基因構(gòu)成嵌合基因,并把此基因?qū)腭R鈴薯,結(jié)果加信號(hào)肽序列的CecropinB轉(zhuǎn)基因植株發(fā)青枯病延遲,病情指數(shù)降低。Yarus等[24]用顯微注射法將牛氣管抗菌肽基因轉(zhuǎn)入小鼠,轉(zhuǎn)基因鼠在牛氣管抗菌肽基因控制序列的驅(qū)動(dòng)下成功的表達(dá)了牛氣管抗菌肽,在鼠乳中的牛氣管抗菌肽對(duì)大腸桿菌具有抗菌活性。Reed等研究了以IL-2啟動(dòng)子/增強(qiáng)子控制轉(zhuǎn)基因鼠中抗菌肽的合成及隨后對(duì)布氏桿菌的抑制作用。Reed[25]構(gòu)建了這樣一個(gè)DN斷:Shivala片斷,SV40多腺苷酸化/剪切信號(hào)肽基因片斷,此片斷加到鼠IL-2基因5’側(cè)-593─110區(qū)域。在受精卵精前核時(shí)將此融合基因注入受精卵(微注射法),得到26系小鼠。RT-PCR檢測:有兩系轉(zhuǎn)基因鼠,當(dāng)其脾淋巴細(xì)胞置于3.25mg/kg的conA(刀豆蛋白,一種抗原誘導(dǎo)物)時(shí),可以誘導(dǎo)產(chǎn)生成熟的ShivalamRNA。用一定量的布氏桿菌接種時(shí),有兩系小鼠遭到攻擊。四星期后,在轉(zhuǎn)基因鼠脾臟組織布氏桿菌比非轉(zhuǎn)基因鼠少得多(P<0.05)。DavidWinder等[26]把編碼Ceropin或Melittin的基因放置在MLV(鼠白血病病毒)的啟動(dòng)子下,轉(zhuǎn)染到EJ細(xì)胞(人膀胱癌細(xì)胞),然后把這些細(xì)胞注入到裸鼠內(nèi),發(fā)現(xiàn)這些腫瘤細(xì)胞停止生長或生長減弱DavidWinder等用PCR擴(kuò)增,Prepromelittin(PPM前蜂毒素原),Premelittin(PM前蜂毒素)和Prececroppin(PC前抗菌肽)三種核酸片斷,均置于MLV啟動(dòng)子下構(gòu)建融合基因轉(zhuǎn)染進(jìn)EJ細(xì)胞。三種類型的EJ細(xì)胞分別注入裸鼠后,測定50d后的腫瘤生長情況,無抗菌肽基因片斷的EJ細(xì)胞(對(duì)照組)致瘤率為70%,帶Cecropin基因片斷的EJ細(xì)胞致瘤率只有39%,PPM為50%,PM為65%,其抑制腫瘤的效果明顯。

5.抗菌肽的應(yīng)用前景

目前,大部分植物抗菌肽是從植物種子中分離獲得的,它們可以保護(hù)植物組織和種子不受真菌病原菌的侵害,但是植物抗菌肽對(duì)大部分細(xì)菌無抑制活性。因此,依靠基因工程的方法用其它真核生物的抗菌肽基因來轉(zhuǎn)化農(nóng)作物,培育抗病新品種是當(dāng)前國內(nèi)外研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

動(dòng)物抗菌肽和干擾素、補(bǔ)體一樣是機(jī)體非特異性天然防御系統(tǒng)的重要組成部分。機(jī)體受損傷或病原微生物入侵時(shí),能迅速產(chǎn)生抗菌肽來殺傷入侵者,它對(duì)正常真核細(xì)胞幾乎沒有作用。另外,因?yàn)榭咕牡暮铣伤俣确浅？?假定核糖體上肽鍵合成速率不變,抗菌肽的產(chǎn)生比IgM要快100多倍),［27］而且小肽的擴(kuò)散比大的蛋白質(zhì)和免疫細(xì)胞更加迅速,作用更顯靈活,所以Boman曾指出,抗菌肽是機(jī)體的一種理想的一線防御物。與普通抗生素相比,抗菌肽的“抗菌譜”更廣,除了抗細(xì)菌外,有的抗菌肽還能作用于真菌、原蟲、有包膜的病毒及癌細(xì)胞(對(duì)癌細(xì)胞的選擇性作用可能與其細(xì)胞骨架的改變有關(guān)),同時(shí)能加速免疫和傷口愈合過程。這預(yù)示抗菌肽在治療及預(yù)防癌癥和抗病毒、抗感染等方面具有良好的應(yīng)用前景。更為重要的是,由于抗生素的濫用導(dǎo)致菌株產(chǎn)生了抗性,人們需要尋找新的抗菌藥劑?？咕倪@種從生物體中獲得的物質(zhì)恰巧具有獨(dú)特的抗菌機(jī)理,不是像一般的抗生素那樣通過阻斷生物大分子的生物合成來發(fā)揮作用,因而極有希望開發(fā)成為一類新型的廣譜高效抗菌藥物。

隨著研究工作的進(jìn)一步深入,可以預(yù)見,抗菌肽及其基因工程在醫(yī)藥、衛(wèi)生、食品工業(yè)及農(nóng)業(yè)等方面將會(huì)發(fā)揮更為重要的作用。另外,有些抗菌肽分子中含有D-氨基酸,這也為研究D-氨基酸如何在核糖體上合成多肽提供了一個(gè)理想的模式體系。

6.研究展望及存在問題

抗菌肽是哺乳動(dòng)物防御系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分,具有熱穩(wěn)定、水溶性好、廣譜殺菌甚至有的能殺真菌、原蟲等優(yōu)點(diǎn),而且許多抗菌肽在100℃加熱10min條件下仍能保持一定活力,且對(duì)較大的離子強(qiáng)度和較低或較高的pH都有較強(qiáng)的抗性,而對(duì)真核細(xì)胞幾乎無作用,僅作用于原核細(xì)胞和發(fā)生病變的真核細(xì)胞,并且與抗生素通過阻斷大分子生物合成的作用機(jī)制完全不同,病源菌不易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性,由此顯示了它具有獨(dú)特的研究和應(yīng)用價(jià)值。近20年來,人們對(duì)昆蟲抗菌肽已進(jìn)行了比較系統(tǒng)的理論和應(yīng)用研究,但有關(guān)畜禽抗菌肽基因工程應(yīng)用研究方面的報(bào)道較少。從哺乳動(dòng)物抗菌肽特有的性質(zhì),顯示了它具有以下幾個(gè)方面在畜牧生產(chǎn)上的研究和應(yīng)用前景。研究展望及存在問題

6.1藥用前景隨著傳統(tǒng)抗生素的廣泛及長期的應(yīng)用,許多病源菌對(duì)它們產(chǎn)生了耐藥性,而具有廣譜抗菌且有獨(dú)特的抗菌機(jī)制的抗菌肽顯然在這方面的應(yīng)用研究中具明顯優(yōu)勢。隨著對(duì)抗菌肽結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系、抗菌肽作用機(jī)制及其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深化,設(shè)計(jì)一種高效的、有利于人類健康的抗菌肽作抗生素替代品是完全可行的。

6.2轉(zhuǎn)基因研究及應(yīng)用仔豬腹瀉、奶牛乳房炎及各種病毒性疾病如豬瘟、雞新城疫等一直是棘手的疾病,不利于畜牧業(yè)的發(fā)展。借鑒已成功的昆蟲抗菌肽轉(zhuǎn)基因工程,如轉(zhuǎn)基因蚊子、轉(zhuǎn)基因馬鈴薯、轉(zhuǎn)基因水稻等,把特異的抗菌肽基因轉(zhuǎn)入畜禽特定細(xì)胞讓其表達(dá),從而產(chǎn)生抗病新品種,不失為一條發(fā)展畜牧生產(chǎn)的新思路,前景深遠(yuǎn)。

6.3抗菌肽基因表達(dá)調(diào)控及抗菌肽添加劑研究研究表明,［28］抗生素添加劑的使用嚴(yán)重破壞了動(dòng)物腸道的微生物平衡,并易在動(dòng)物體內(nèi)殘留,嚴(yán)重影響了畜產(chǎn)品的品質(zhì)和人類的健康。用基因工程方法生產(chǎn)環(huán)保型抗菌肽添加劑,或者,通過日糧因素調(diào)控抗菌肽基因的表達(dá)而達(dá)到畜產(chǎn)品無抗素化值得進(jìn)一步研究。

然而,由于抗菌肽分子小,分離提純存在一定的困難,故天然資源有限?；瘜W(xué)合成和基因工程法獲得抗菌肽是主要手段,但化學(xué)合成抗菌肽成本高,而通過基因工程在微生物中直接表達(dá)抗菌肽基因,則可能對(duì)宿主有害而不能獲取表達(dá)產(chǎn)物。所以,對(duì)抗菌肽的結(jié)構(gòu)、構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

7.結(jié)束語

抗菌肽是生物體對(duì)外界病原物質(zhì)侵染而產(chǎn)生的一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)產(chǎn)物,它的出現(xiàn)為人們尋找理想的抗菌藥物提供新的領(lǐng)域,尤其是當(dāng)今許多抗生素產(chǎn)生了耐藥性,因此抗菌肽具有巨大的應(yīng)用潛力。基因工程技術(shù)的發(fā)展,極大的促進(jìn)了抗菌肽的研究和開發(fā),通過抗菌肽基因的克隆與表達(dá)而大量生產(chǎn)成為可能。雖然抗菌肽目前還不能直接應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè),但抗菌肽獨(dú)特的作用機(jī)理不易產(chǎn)生耐藥性的特性將吸引科研工作的不斷深入,可以相信抗菌肽將在動(dòng)物養(yǎng)殖和提高畜產(chǎn)品品質(zhì)方面發(fā)揮重要作用。

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