新世紀(jì)伊始，人類社會步入了快速發(fā)展和劇烈變動之中。在這一系列的發(fā)展變動之中，克隆技術(shù)備受關(guān)注，日漸成為人們生活中的一個重要名詞。一方面，由于克隆技術(shù)給人類生活帶來的美好前景，人們對它寄予了無限的期望；而另一方面，又由于其可能給人類社會造成不確定的抑或是災(zāi)難性的后果，不少人視之為洪水猛獸而強烈反對。2004年11月19日聯(lián)合國一次會議放棄了制定一項禁止生殖性克隆人的國際條約的努力。在這次大會上，由于爭論陷入僵局，由哥斯達黎加等60國提出的要求全面禁止克隆人試驗的提議，和由比利時提出的禁止生殖性克隆人研究、允許治療性克隆研究的提議均未通過。克隆技術(shù)目前發(fā)展?fàn)顩r如何？克隆人究竟離我們有多遠(yuǎn)？克隆技術(shù)產(chǎn)生了哪些倫理問題？克隆技術(shù)可以禁止嗎？倫理學(xué)不能接納這項新技術(shù)嗎？我們應(yīng)該怎樣對待克隆技術(shù)的發(fā)展？本文擬就這些問題進行一些討論。

一、克隆技術(shù)的發(fā)展使克隆人成為可能

上世紀(jì)初，韋伯（H.J.Webber）創(chuàng)造了“克隆”這一詞，其含義指由單個祖先個體經(jīng)過無性繁殖而產(chǎn)生的其他個體。由于該詞構(gòu)詞簡短，容易發(fā)音，能清晰表達出準(zhǔn)確的意思，因此這一術(shù)語很快得到學(xué)術(shù)界的認(rèn)同并加以廣泛使用[1](P.160)。1952年，科學(xué)家開始用青蛙進行克隆實驗。從此以后，動物克隆的試驗結(jié)果不斷涌現(xiàn)。1970年克隆青蛙實驗取得突破，青蛙卵發(fā)育成了蝌蚪。1984年第一只胚胎克隆羊誕生。1997年2月24日，英國羅斯林研究所的科學(xué)家用取自一只6歲成年羊的乳腺細(xì)胞培育成功一只克隆羊。1998年7月，日本科學(xué)家利用成年動物體細(xì)胞克隆的兩頭牛犢誕生。2000年1月，美國科學(xué)家宣布克隆猴成功。2000年3月14日，曾參與克隆小羊“多莉”的英國PPL公司宣布，他們成功培育出5頭克隆豬。

隨著一系列克隆技術(shù)突破的完成，克隆人從技術(shù)上來講已成為可能。有的科學(xué)家認(rèn)為，從技術(shù)上說克隆人并不比克隆其他哺乳動物更困難?？寺∪思磳⒊鍪赖南⒁膊粩鄠鱽?。意大利著名的“克隆狂”安蒂諾里曾宣布，克隆胎兒將于2003年1月問世。2003年第一期《發(fā)現(xiàn)》雜志也把2002年“命名”為“克隆年”，理由是克隆技術(shù)在當(dāng)時已經(jīng)進入了克隆人的階段。該雜志斷言：“雖然世界不想要克隆人，但克隆人卻將要出現(xiàn)。”

但是至今我們沒有見到克隆人的問世，原因是盡管克隆技術(shù)出現(xiàn)了長足的進步，但是仍然存在著一些目前尚沒有解決的問題。在理論上，分化的體細(xì)胞克隆對遺傳物質(zhì)重編（細(xì)胞核內(nèi)所有或大部分基因關(guān)閉，細(xì)胞重新恢復(fù)全能性的過程）的機理還不清楚；克隆動物是否會記住供體細(xì)胞的年齡，克隆動物的連續(xù)后代是否會累積突變基因，以及在克隆過程中胞質(zhì)線粒體所起的遺傳作用等問題還沒有解決。在實踐中，存在著低著床率、高流產(chǎn)率的問題，維爾穆特研究組在培育“多莉”的實驗中，融合了277枚移植核的卵細(xì)胞，僅獲得了“多莉”這一只成活羔羊，成功率只有0.36％，同時進行的胎兒成纖維細(xì)胞和胚胎細(xì)胞的克隆實驗的成功率也分別只有1.7％和1.1％。此外，生出的許多個體表現(xiàn)出生理缺陷或畸形。以克隆牛為例，日本、法國等國培育的許多克隆牛在降生后兩個月內(nèi)死去[2]。觀察結(jié)果表明，部分牛犢胎盤功能不完善，其血液中含氧量及生長因子的濃度都低于正常水平；有些牛犢的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常發(fā)育；克隆動物胎兒普遍存在比一般動物發(fā)育快的傾向，這些都可能是死亡的原因。

雖然存在各種各樣的問題，但幾年來克隆技術(shù)的發(fā)展表明，世界各科技大國都不甘落后，誰也沒有放棄克隆技術(shù)研究。同時，克隆人的出現(xiàn)越來越成為可能，人們對其可能產(chǎn)生的倫理問題表現(xiàn)出了空前的擔(dān)心。

1材料與方法

基因DNA模板、PCMV陽性血清、表達載體pET32a（＋）均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心提供，2月齡健康雄性白兔（體重2kg）購自雅安市某家兔養(yǎng)殖基地。克隆載體pMD19－TSimple，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ、T4DNA連接酶、IPTG、蛋白質(zhì)Marker購自大連寶生物工程有限公司；、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、購自北京天根生化科技有限公司；N，N’－亞甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、SDS、TEMED、考馬斯亮藍R－250、2－巰基乙醇、溴酚藍、瓊脂糖、甘油、氨芐青霉素、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、硫酸銨等均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，其他化學(xué)試劑均為分析純。引物的設(shè)計與合成應(yīng)用．0b等分子生物信息軟件對PCMVgB基因及其編碼氨基酸序列進行生物信息學(xué)分析，并選擇gB基因2305～2574bp優(yōu)勢抗原表位區(qū)作為目的序列，參照NCBI上的豬巨細(xì)胞病毒gB基因序列（登錄號：FJ844360．1），應(yīng)用Oligo7．0軟件設(shè)計引物P1、P2，在引物P1、P2的5′端分別引入酶切位點EcoRⅠ和HindⅢ，用于PCR產(chǎn)物與表達載體的連接，并在引物P1、P2酶切位點后分別引入起始密碼子ATG和終止密碼子TAG。P1／P2擴增的目的片段長270bp，上述引物送上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如下（下劃線處為EcoRⅠ酶切位點），下劃線處為HindⅢ酶切位點）。PCMVgB基因優(yōu)勢抗原表位區(qū)的PCR擴增以gB基因DNA為模板，分別以P1、P2為上游引物和下游引物，對PCMVgB基因優(yōu)勢抗原表位區(qū)進行體外擴增。PCR反應(yīng)的程序為：94℃預(yù)變性，經(jīng)30個循環(huán)后，于72℃延伸8min。基因優(yōu)勢抗原表位區(qū)表達載體的建立及重組蛋白的表達與純化將PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳后，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收目的片段，將目的片段連入pMD19－TSimple克隆載體并轉(zhuǎn)化入E．coliDH5α后抽提質(zhì)粒，進行質(zhì)粒基因組測序，并使用EcoRⅠ和HindⅢ進行酶切，將酶切后的目的片段連接入pET32a（＋）載體，并命名重組質(zhì)粒為pET32a（＋）－gB，轉(zhuǎn)化入E．后將重組表達菌命名為E．。使用濃度為0．2mg／L的IPTG誘導(dǎo)E．重組表達菌表達后，將表達產(chǎn)物通過組氨酸標(biāo)簽融合蛋白純化柱進行純化，并測定純化后的蛋白質(zhì)濃度。PCMVgB基因優(yōu)勢抗原表位區(qū)重組蛋白的反應(yīng)原性分析以純化的PCMVgB基因優(yōu)勢抗原表位區(qū)重組蛋白作為抗原，PCMV陽性血清為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG為二抗進行試驗，并設(shè)置PCMV陰性血清對照組，鑒定PCMVgB基因優(yōu)勢抗原表位區(qū)重組蛋白的反應(yīng)原性。多克隆抗體的制備及抗體效價的測定使用純化后的PCMVgB基因優(yōu)勢抗原表位區(qū)重組蛋白與弗氏佐劑按1∶1體積比進行乳化后制成油乳劑，對健康家兔進行免疫，第4次免疫完成后對試驗家兔采取心血，將血液收集至離心管中，先于常溫傾斜放置30min，再轉(zhuǎn)至37℃培養(yǎng)箱中放置1h，最后轉(zhuǎn)入4℃冰箱中放置過夜，于4000r／min離心15min分離血清。將分離的血清無菌進行分裝后于－20℃保存?zhèn)溆茫⒈苊夥磸?fù)凍融。以純化后的PCMVgB優(yōu)勢抗原表位區(qū)重組蛋白（質(zhì)量濃度為0．62μg／mL）作為抗原，以瓊脂擴散試驗驗證經(jīng)PBS緩沖液稀釋后的多克隆抗體效價。鑒定以純化的PCMVgB優(yōu)勢抗原表位區(qū)重組蛋白作為抗原，制備的多克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進行Western－blot鑒定，以免疫前的家兔血清作為陰性對照，鑒定該多克隆抗體的反應(yīng)性。

2討論

自1950年P(guān)CMV在英國被發(fā)現(xiàn)以來，該病毒就因為其免疫抑制特性以及能夠通過跨物種器官移植而感染人與其他動物而備受關(guān)注，但由于該病毒分離困難，導(dǎo)致了對該病毒的研究一直落后于其他皰疹病毒科病毒。囊膜糖蛋白B（gB）是PCMV重要的跨膜糖蛋白，也是特定細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的主要靶蛋白，是淋巴因子激活的自然殺傷細(xì)胞的識別對象，且gB蛋白具有良好的免疫原性，并在誘導(dǎo)機體體液免疫和細(xì)胞免疫中起著重要作用，對該蛋白進行研究有助于了解PCMV的感染機制，為該病毒感染的防治奠定了基礎(chǔ)。本試驗構(gòu)建了pET32a（＋）－gB高效重組表達質(zhì)粒，應(yīng)用原核表達系統(tǒng)以可溶性形式高效表達了PCMVgB優(yōu)勢抗原表位區(qū)重組蛋白，成功表達并純化了PCMVgB優(yōu)勢抗原表位區(qū)重組蛋白，并驗證了其具有良好的反應(yīng)原性，可以作為間接ELISA檢測的包被抗原，通過瓊脂擴散試驗和Western－blot試驗，也證實了制備的多克隆抗體可以與gB蛋白特異性結(jié)合。本研究為進一步分析PCMVgB蛋白的生物學(xué)特性，建立PCMV抗體血清學(xué)診斷方法奠定了重要基礎(chǔ)，為制備早期檢測PCMV抗體的檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

作者：江一帆劉驍單位：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)

一電路設(shè)計與實現(xiàn)

國內(nèi)已有的研究文獻，只是對仲裁器PUF進行了改進，但并沒有提高仲裁器PUF在不同芯片中的差異性以及系統(tǒng)的穩(wěn)定性，也未對具體的應(yīng)用進行描述。對此，本文設(shè)計了由多路仲裁器PUF電路、多數(shù)表決器和運算門陣列三部分組成的防克隆電路，用以解決上述問題。

1多路仲裁器PUF電路設(shè)計

仲裁器使用D觸發(fā)器，D觸發(fā)器不易進入亞穩(wěn)態(tài)。即使信號傳輸?shù)难訒r差小于D觸發(fā)器建立時間，它的輸出也是一個穩(wěn)定的狀態(tài)，不是‘1’就是‘0’。但根據(jù)以往研究者的資料和實際實驗測試，使用了D觸發(fā)器的仲裁器PUF存在以下的問題:相同電路在不同芯片間的傳輸延時差異性減小，張俊欽等人測得該差異產(chǎn)生的概率約為11.2%;針對此問題，文中共設(shè)計了8支仲裁器PUF電路。每支仲裁器PUF由128個開關(guān)單元組成，結(jié)構(gòu)完全一致，但選擇位F(0．．．127)不同。左半部分為8支仲裁器PUF，右半部分為其中一支仲裁器PUF的局部放大圖。F［0］～F［10］為一部分選擇位，“信號輸入”代表仲裁器PUF的輸入端，“信號輸出”代表仲裁器PUF的輸出端。每一支仲裁器PUF電路都通過運算門陣列與被保護電路的輸出進行運算。因此，只要有一支電路的延時差發(fā)生差異，最終的輸出都會發(fā)生變化。而最終的輸出發(fā)生變化的概率，即8支電路中至少有一支在不同芯片中產(chǎn)生延時差異的概率為1－1－0．()1128=61.34%。理論上，PUF的數(shù)量越多，上述的概率就越高，但考慮到FPGA資源有限，過多的PUF電路會占用過多的空間，因此只設(shè)計了8支電路，而此概率已遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于D.Lim等人得到的23%的概率。在設(shè)計中，通過分析不同的選擇位對應(yīng)的響應(yīng)，確定每支PUF電路的選擇位，使得輸出結(jié)果中，各有4支電路的輸出為‘1’和‘0’，保持了‘1’和‘0’的均衡性，從而加大敵方破解的難度。經(jīng)過實驗，使用8支電路達到了預(yù)期的效果。此外，仲裁器PUF的輸出取決于上下兩條線路的延時差，而電路的布局布線對延時有很大的影響。每次進行重新編譯時，布局布線都有可能發(fā)生改變，導(dǎo)致延時差發(fā)生變化，從而引起輸出的改變。同時，即使在同一塊芯片中，也可能存在著工藝不均勻的情況，所以仲裁器PUF布局在不同的位置，就可能會產(chǎn)生不同的輸出。考慮到這點，在實際操作中，本文使用了Altera公司QuartusII的高級功能邏輯鎖(LogicLock)，將設(shè)計好的仲裁器PUF電路鎖定在了芯片的固定區(qū)域內(nèi)，減小了布局布線及芯片不均勻產(chǎn)生的影響，同時給被保護電路的設(shè)計留出了足夠的芯片資源，使得兩者不會產(chǎn)生干擾，還有利于團隊的分工和協(xié)作，提高效率。

2多數(shù)表決器為保證系統(tǒng)穩(wěn)定

要求仲裁器PUF在同一芯片中對同一激勵的響應(yīng)保持恒定。在實際應(yīng)用中，氣溫變化與電壓不穩(wěn)是電子設(shè)備面臨的兩個最大難題，仲裁器PUF也不能例外。盡管D.Lim等人測得仲裁器PUF在同一芯片中對同一激勵的響應(yīng)發(fā)生變化的概率只有0.7%，但該數(shù)據(jù)是在溫度范圍為40～70℃，電壓變化幅度為±2%的情況下測得的。若電子設(shè)備要求必須能在極端環(huán)境下正常工作，上述測試環(huán)境下的數(shù)據(jù)顯然不能滿足要求。因此必須進行電路設(shè)計，保證輸出的穩(wěn)定性。借鑒文獻提到的方法，對每一支仲裁器PUF在同一激勵下的多次響應(yīng)進行寄存，然后對寄存的響應(yīng)進行多數(shù)表決。由此可以有效避免因外部環(huán)境變化而對輸出產(chǎn)生的影響。其中多數(shù)表決器由VHDL寫成，并生成符號(symbol)，與仲裁器PUF在原理圖環(huán)境中進行編譯，

1材料與方法

下游引物P，下劃線處分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點。上述引物由大連寶生物工程有限公司合成。L基因的克隆與鑒定以綿羊痘病毒基因組DNA為模板，采用50μL體系進行PCR擴增。將純化的PCR產(chǎn)物與mple克隆載體連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆培養(yǎng)后小量制備質(zhì)粒進行酶切鑒定，并測序。綿羊痘病毒E3蛋白的生物信息學(xué)分析將測序結(jié)果應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫ORFfinder程序推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸序列，并應(yīng)用Weblab服務(wù)器中法對SPPVE3蛋白和VVE3蛋白的核苷酸和氨基酸序列進行比對。二級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)柔性區(qū)域分析分別使用軟件的法和法進行預(yù)測。蛋白中氨基末端和羧基末端2個功能域的三級結(jié)構(gòu)使用SWI服務(wù)器進行預(yù)測。重組載體的構(gòu)建及重組蛋白的誘導(dǎo)表達、純化E3L重組載體和表達載體pGEX4T－1分別用酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后用凝膠回收試劑盒回收目的條帶，16℃連接過夜，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。毒株綿羊痘病毒古浪株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室分子免疫與環(huán)境控制課題組分離、鑒定和保存。主要試劑TaqDNA聚合酶、載體、大腸桿菌菌株連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ均購自大連寶生物工程有限公司；pGEX4T－1表達載體表達菌、GST結(jié)合樹脂和硝酸纖維素膜購自公司；氨芐青霉素、IPTG、弗氏佐劑和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗山羊IgG購自Sigma公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自公司；化學(xué)發(fā)光底物購自公司；X光底片、顯影及定影液均購自柯達公司；其他試劑均為進口分析純。引物的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank中登錄號為的基因組序列，利用軟件設(shè)計了1對引物，預(yù)期擴增產(chǎn)物的大小為534bp。上游引物P，挑取陽性克隆培養(yǎng)后小量制備質(zhì)粒進行酶切鑒定，并測序。將鑒定正確的重組載體轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）pLysS感受態(tài)細(xì)胞，37℃振蕩培養(yǎng)至?xí)r，加入IPTG至終濃度為1mmol／L誘導(dǎo)培養(yǎng)離心10min收集菌體，處理后進行檢測。用裂解緩沖液重懸誘導(dǎo)表達的菌體，在冰浴條件下進行超聲破碎（超聲5s，停8s）至溶液澄清，離心，分別取上清和沉淀進行SDS－PAGE，分析重組蛋白SPPVE3的可溶性。重組蛋白使用Novagen公司的GST結(jié)合樹脂進行純化。重組蛋白鼠抗血清的制備及分析選取周齡的BALB／c小鼠進行免疫：初次免疫時，用純化后的重組蛋白SPPVE3與等量弗氏完全佐劑混合，經(jīng)乳化后皮下多點注射；第14天，用相同劑量的重組蛋白與弗氏不完全佐劑混合，乳化后加強免疫。二免后第14天采血，分離血清，用純化的重組蛋白SPPVE3包被ELISA板，進行間接ELISA試驗，測定血清效價。

2SPPVE3L基因的序列分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測經(jīng)測序分析

SPPVE3L基因全長534bp，編碼177位氨基酸，分子質(zhì)量約為。使用法分析，基因與VVE3L基因的核苷酸序列具有50．8％的一致性，在氨基酸水平上具有34．9％的一致性（50．0％的相似性。從功能結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列分析蛋白的氨基酸末端序列與E3蛋白ZDBD相比具有28．2％的一致性（47．4％的相似性），而羧基末端與DRBD相比具有41．9％的一致性（52．7％的相似性）使用法預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)α－螺旋主要存在于位氨基酸；β－折疊主要分布于位氨基酸；利用法預(yù)測蛋白質(zhì)柔性，結(jié)果表明較大的柔性區(qū)域分布于位氨基酸。根蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測服務(wù)器，對SPPVE3蛋白的氨基末端和羧基末端2個潛在的功能結(jié)構(gòu)域氨基酸序列進行蛋白三級結(jié)構(gòu)的同源建模。構(gòu)建的氨基酸區(qū)域分別為3～71和102～173位氨基酸，參考模板分別為E3蛋白的Z－DNA結(jié)合域和PKR的dsRNA結(jié)合域。序列一致性分別為40．58％和26．027％，E值分別為E－21和1．8E－16，表明模型構(gòu)建可靠。重組質(zhì)粒的鑒定及重組蛋白的誘導(dǎo)表達與純化經(jīng)酶切鑒定（見圖6）及測序鑒定，表明E3L重組載體構(gòu)建正確。含有重組載體的BL21（DE3）pLysS重組菌在濃度為1mmol／L條件下誘導(dǎo)4h后，經(jīng)E電泳分析，顯示在46ku處表達出一條明顯的條帶，分子質(zhì)量與預(yù)期大小一致。經(jīng)可溶性分析，表明重組蛋白主要以可溶形式存在于菌體中，經(jīng)GST結(jié)合瓊脂可純化出目的條帶重組蛋白SPPVE3鼠抗血清的制備分析用綿羊痘病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和制備的鼠抗血清對SPPVE3蛋白進行分析，結(jié)果顯示所制備的鼠抗血清可以與重組蛋白發(fā)生反應(yīng)。對制備的重組蛋白SPPVE3鼠抗血清進行間接ELISA檢測，其效價為。

3討論

蛋白是痘苗病毒中重要的免疫逃避因子，主要由位于氨基酸末端的ZDBD和羧基末端的DRBD兩個關(guān)鍵的功能結(jié)構(gòu)域組成。其中，E3蛋白的羧基末端能夠通過其dsRNA結(jié)合域阻斷病毒復(fù)制周期中產(chǎn)生的dsRNA，抑制了Toll樣受體、人視黃酸誘導(dǎo)基因／RIG樣受體以及細(xì)胞內(nèi)PKR和OAS等各類抗病毒信號通路和抗病毒分子的活性，病毒得以正常復(fù)制。目前，除了VV外，E3蛋白的同源蛋白在羊口瘡病毒（ORFV）中已進行了較為深入的研究，結(jié)果顯示在體外細(xì)胞試驗中，ORFVE3蛋白取代VVE3蛋白后構(gòu)建的重組病毒VV／ORFVE3與野生型VV致病性并無明顯差別，但在動物試驗中，的致病性顯著降低。等報道SPPV基因組的第34號開放閱讀框編碼VVE3蛋白的同源蛋白，表明SPPV可能編碼類似VVE3蛋白的免疫逃避因子。SPPV主要引起感染綿羊全身皮膚（特別是身體無毛部分）出現(xiàn)典型的痘瘡，造成家畜產(chǎn)奶量下降、體重減輕、流產(chǎn)率增加以及對肺炎和皮毛蠅蛆病的易感性增加，同時也會造成直接死亡。本試驗中，筆者以綿羊痘病毒甘肅古浪株為模板克隆出綿羊痘病毒E3L同源基因，基因全長534bp，編碼177個氨基酸。經(jīng)過序列比對，SPPVE3蛋白與VVE3蛋白核苷酸序列的一致性達到50．8％，而氨基酸序列一致性為34．9％（相似性為50．0％）。從功能結(jié)構(gòu)域角度分析，SPPVE3蛋白與VVE3蛋白ZDBD的一致性只有28．2％（相似性為47．4％）；而DRBD一致性雖然高達41．9％（相似性為52．7％），但在決定dsRNA結(jié)合活性的和A174氨基酸殘基中，第174位氨基酸殘基中A→S的突變可能使其dsRNA結(jié)合活性大大降低，推測SPPVE3蛋白對干擾素的抑制效應(yīng)將會減弱。在本研究中，以pGEX4T－1為載體，表達出大小為46ku左右的重組蛋白。利用純化后的重組蛋白免疫BALB／c小鼠獲得鼠抗血清，經(jīng)間接ELISA測定效價為。利用制備的抗體能夠分析SPPV在感染細(xì)胞后E3蛋白的表達情況以及對PKR等抗病毒分子的影響，為闡明羊痘病毒的致病機理奠定了基礎(chǔ)。

1材料和方法

蛹期開始將雌雄分開飼養(yǎng)，羽化后喂以5%的蜂蜜水。養(yǎng)蟲室溫度為26℃，相對濕度為70%～80%，光周期16D∶8L?？俁NA的提取及cDNA第一鏈的合成為測定氣味結(jié)合蛋白基因的組織表達譜，取3齡幼蟲頭部和去除頭部的剩余組織，取3日齡雌雄成蟲的不同組織(觸角、去除觸角的頭、胸、腹、足、翅)，其中，雄蟲觸角收取30對，雌蟲觸角收取40對，其他組織適量，重復(fù)3次。組織收取后立即放入液氮中，－70℃保存?zhèn)溆?。按照說明書，用SVTotalRNAIsolationSystem提取總RNA，然后用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，－20℃保存?zhèn)溆?。RACE擴增利用本研究組委托深圳華大科技有限公司測得的二化螟基因組數(shù)據(jù)，與GenBank中的OBP序列進行比對得到CsupOBP1基因的cDN段。根據(jù)片段序列，設(shè)計合成5''''GSP和3''''GSP引物。依據(jù)擴增試劑盒操作說明，進行RACEcDNA第一鏈的合成及PCR擴增。PCR產(chǎn)物用1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標(biāo)條帶經(jīng)AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收后，連接到pEASYTM-T3載體上，然后轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化后的菌落經(jīng)藍白斑篩選，挑取單個白色菌落放入含有0．1%Amp的LB培養(yǎng)液中，在250r/min、37℃下震蕩培養(yǎng)12～16h后，采用質(zhì)粒提取試劑盒(Omega，USA)提取質(zhì)粒，送南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測序。

2序列分析

測定為了明確二化螟OBP1基因的組織表達譜，利用ABI7500Real-timePCRSystem進行了相對表達量測定。內(nèi)參基因為3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因和轉(zhuǎn)錄延長因子4(E2F)基因，用于實時熒光定量PCR的引物序列。RT-qPCR反應(yīng)體系為模板2．0μL，超純水補足至20μL。采用兩步法標(biāo)準(zhǔn)程序進行擴增:95℃預(yù)變性30s;95℃5s，60℃34s，共40個循環(huán)。反應(yīng)后進行溶解曲線分析，以排除非特異性PCR產(chǎn)物的污染，空白對照模板以超純水代替cDNA。蛋白的原核表達與純化根據(jù)二化螟OBP1閱讀框序列及表達載體pET-30a(+)設(shè)計帶有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(以下劃線標(biāo)示)的引物序列。以成蟲觸角cDNA為模板，采用高保真性和高擴增效率的DNA聚合酶PrimeSTARHSDNAPolymerase，按照PrimeSTAR說明書進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物回收，再連接到pEASYTM-T3載體中并轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒DNA并測序驗證。將含有目的片段的重組質(zhì)粒DNA和pET-30a(+)質(zhì)粒DNA分別進行雙酶切，然后將目的片段連接到pET-30a(+)載體，再轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。用含抗生素卡那霉素的LB平板進行篩選，挑取陽性克隆，小量提取質(zhì)粒進行測序。經(jīng)測序驗證后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂板培養(yǎng)后挑取單菌落接種于5mLLB培養(yǎng)液(含Kan50μg/mL)中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日，將所得菌液按1/100(v/v)的比例接種于新鮮的LB培養(yǎng)液(含Kan50μg/mL)中，37℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至OD600=0．6時，加入IPTG(終濃度為1mmol/L)，37℃下250r/min振蕩培養(yǎng)5h。將菌液8000×g離心20min后收集沉淀(菌體)，加入預(yù)冷的Resuspensionbuffer(20mmol/LTris-HCl，0．5mmol/LNaCl，pH7．將沉淀重新懸浮，超聲破碎后用12000×g離心15min，分別收集上清及沉淀，用SDS-PAGE檢測重組蛋白是否為可溶性蛋白。重組蛋白的純化使用裝有填料的親和層析柱XK16/20，對純化后的重組蛋白進行腸激酶酶切以切除His-tag標(biāo)簽，酶切后的重組蛋白再次過親和層析柱。純化后的目的蛋白經(jīng)過透析(除鹽)、冷凍干燥后，保存于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

3熒光競爭結(jié)合實驗

緩沖液中，配成蛋白溶液，測定濃度。熒光探針1-NPN和氣味物質(zhì)(植物揮發(fā)性化合物，見表2)溶于甲醇中，使其終濃度為1mmol/L，作為工作液。以1-NPN為探針，利用熒光競爭結(jié)合實驗測定氣味物質(zhì)和OBP間的親和力已有很多報道(Zhouetal．，2004b;Heetal．，2011;Qiaoetal．，2011;孫紅巖等，2011;LiuNYetal．，2012;LiuSJetal．，2012;張婷等，2012;Lietal．，2013)。首先測定CsupOBP1與1-NPN的結(jié)合曲線。將蛋白溶液加入20mmol/L的Tris-HCl緩沖液中，使其終濃度為2μmol/L，按和20μmol/L的濃度梯度加入1-NPN，每次加入后反應(yīng)2min，在337nm激發(fā)，記錄熒光發(fā)射情況，利用其熒光值計算出該蛋白與1-NPN的結(jié)合常數(shù)，然后利用競爭結(jié)合實驗測定氣味物質(zhì)和蛋白的結(jié)合能力。在競爭結(jié)合實驗中，蛋白和1-NPN的濃度均為2μmol/L，反應(yīng)時間為2min，在337nm激發(fā)，記錄熒光值(初始熒光值)。然后將被測氣味物質(zhì)按終濃度和20μmol/L的濃度梯度加入到1-NPN和蛋白的混合液中，每次加入后反應(yīng)2min，記錄熒光值。對于濃度在20μmol/L時相對熒光值降到60%以下的氣味物質(zhì)，再進行2次重復(fù)試驗，以3次重復(fù)計算有關(guān)參數(shù);對于結(jié)合能力較低的氣味物質(zhì)，第一次測定后不再進行重復(fù)試驗。計算熒光值降低到初始熒光值一半時氣味物質(zhì)的濃度，即IC50值，利用公式Ki=IC50/(1+［1-NPN］/K1-NPN)計算各氣味物質(zhì)的結(jié)合常數(shù)，其中［1-NPN］為未結(jié)合的1-NPN濃度，K1-NPN為1-NPN與二化螟OBP1的結(jié)合常數(shù)(Banetal．，2003)。